Présentation
Le plateau technique de Biologie Moléculaire Environnementale (BME) s’appuie sur les compétences de l’équipe MIC du LCPME pour proposer des prestations dans les domaines de la virologie environnementale et du transfert des éléments génétiques mobiles et gènes d’antibiorésistance. Ces compétences concernent un large panel de matrices comprenant les eaux, les sédiments, mais aussi les mollusques et végétaux. L’originalité du plateau BME réside dans la juxtaposition de méthodes de concentration-purification des particules virales et d’extraction des acides nucléiques à partir de matrices environnementales avec des outils de biologie moléculaire. Le plateau peut combiner des méthodes de biologie moléculaire à la culture cellulaire pour certains virus entériques pathogènes. Il peut également répondre à des demandes concernant la quantification d’éléments génétiques et gènes d’antibiorésistance dans des matrices environnementales, ainsi que leur transfert entre bactéries. Les conditions permissives au transfert d’éléments génétiques mobiles peuvent être étudiées grâce au développement d’une approche d’imagerie innovante par caméra CCD à haute sensibilité à l’aide de biosenseurs bactériens dédiés. Ce plateau est accessible aux structures publiques et privées avec une tarification spécifique.
Services
Production de suspensions de bactériophages : Bactériophages ARN et ADN F-spécifiques, coliphages somatiques, T4, P1, 187, K, … Production d’autres bactériophages en fonction des demandes. Le niveau de purification est ajusté selon les besoins. Les suspensions sont titrées en phages infectieux et en génome.Numération de bactériophages infectieux dans des échantillons d’eau, de mollusques ou de végétaux : Numération des phages ARN F-spécifiques et des coliphages somatiques infectieux à partir d’eaux (usées, de surface), de mollusques (eau de mer : huîtres, moules / eaux douces : dreissènes) ou de végétaux.
Génotypage de bactériophages infectieux : Détermination du génotype des phages ARN F-spécifiques infectieux à partir de plages de lyse.
Quantification de génome viraux dans des échantillons d’eau, de mollusques ou de végétaux : Utilisation de méthodes de RT-quantitative en temps réel et de RT-PCR digitale. Quantification des génomes des norovirus humains (génogroupes I et II), des phages ARN F-spécifiques (génogroupe I, II, III et IV), des adénovirus humains dont génogroupe 41.
Caractérisation physico-chimique de particules virales : Mesures de taille, détermination de l’hydrophobie relative et de la charge électrostatique de particules virales (phages ARN F-spécifiques, coliphages somatiques).
Quantification de gènes d’antibiorésistance et d’élément génétiques mobiles dans des matrices environnementales : les ADN totaux sont extraits à partir de matrices environnementales (eaux, eaux usées, sol, sédiments) et les marqueurs sélectionnés sont quantifiés par qPCR/ddPCR. Une normalisation à la biomasse bactérienne totale grâce au gène de l’ARNr 16S est proposée.
Criblage de molécules antibiotiques pour leurs effets en doses sub-inhibitrices sur l’expression de fonctions bactériennes (au choix) : étude de séquences nucléotidiques et identification des séquences promotrices en amont de gènes d’intérêt, construction de fusions transcriptionnelles promoteur-luxCDABE ou promoteur-gfp, criblage de la réponse du promoteur (induction/répression) par imagerie de luminescence/fluorescence par caméra CCD à haute sensibilité.
Equipements
Extraction des acides nucléiques : Utilisation de différents kits/systèmes manuels, semi-automatique ou automatisé pour l’extraction d’acides nucléiques (ARN et/ou ADN) à partir de différents types et volumes d’échantillons. Les méthodes peuvent être optimisées pour répondre aux spécificités des échantillons.
PCR quantitative : La qPCR (réaction de polymérisation en chaine quantitative) est une technique de biologie moléculaire qui mesure l’abondance de gènes. La mesure de l’abondance de gènes microbiens (copies de gènes par mL, par gramme, par copie de gène ARNr 16S) permet de quantifier tout marqueur d’intérêt ou la biomasse microbienne (bactérienne, virale, archéenne ou fongique).
Extraction des acides nucléiques : Utilisation de différents kits/systèmes manuels, semi-automatique ou automatisé pour l’extraction d’acides nucléiques (ARN et/ou ADN) à partir de différents types et volumes d’échantillons. Les méthodes peuvent être optimisées pour répondre aux spécificités des échantillons.
PCR digitale : Technique de PCR de 3ème génération permettant la quantification absolue de cibles ARN ou ADN sans gamme étalon. L’échantillon et son mix de PCR sont préparés façon identique pour la PCR quantitative, puis séparés en plusieurs milliers de partitions. Chaque partition contient statistiquement 0 ou 1 séquence d’ARN ou d’ADN cible. La distribution statistique des fragments d’ADN dans les compartiments suit la loi de Poisson. Chaque partition se comporte comme un bioréacteur individuel de PCR.
HRM : L’analyse de courbe de fusion à haute résolution (analyse HRM) est l’analyse quantitative des courbes de fusion des fragments d’ADN produits après amplification par PCR. La combinaison d’une instrumentation qPCR améliorée et de colorants de liaison à l’ADN saturants permet l’identification de petites variations dans les séquences d’acides nucléiques (polymorphismes).
Ultracentrifugeuse : L’ultracentrifugation permet de concentrer des particules virales à partir de suspensions de laboratoire ou d’échantillons environnementaux. Elle permet également de purifier des particules virales par des gradients de densité.
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Caméra CCD : Caméra à comptage de photons à haute sensibilité permettant l’imagerie d’émission de luminescence ou de fluorescence. La caméra est utilisable pour identifier des inductions de gènes (gènes d’éléments mobiles, gènes de virulences, …) à partir de fusions transcriptionnelles promoteur-luxCDABE ou promoteur-gfp. L’imagerie est réalisable sur des test de diffusion en gélose (type antibiogramme) ou adaptable à des objets plus complexes (réacteurs, objets biotiques ou abiotiques colonisés).
Cytomètre en flux : La cytométrie en flux permet de compter et de caractériser des cellules en haut débit à l’échelle individuelle. La caractérisation est basée sur des propriétés de diffusion et de fluorescence de la lumière. En particulier, les propriétés de diffusion aux grands et petits angles (ligth scattering) renseignent sur la taille et la granularité des cellules. Le recours à des marqueurs spécifiques (fluorochromes) permet d’évaluer les caractéristiques cellulaires tels que le contenu en ADN, le potentiel de membrane…
